조직 검사학의 실습 2막

①배지 윗부분 멸균 후 SIM 배지에 멸균된 nettle로 균을 따서 천자배양 한다.
(그대로 배지를 수직으로 찔렀다가 빼기-벽면에 묻지 않게 주의!)
②마개를 닫고 사용한 nettle은 알코올램프로 멸균한다.
③35°C 24 hr 하루 동안 배양한다.
➃Kovacs 시약(HCl+알코올)을 4~6방울 떨어뜨려 흔들어준 다음 관찰한다.

SIM 배지로 Indole 생성을 보는데 이외에도 Indole 시험에 이용되는 배지로 pep tone broth, critical broth, SIM, M IO 배지가 이용된다. Indole 생성은 tryptophan이 풍부하게 함유된 배지에서 세균이 tryptophan 분해효소인 세균과 세포를 생성하는가를 알아보는 방법으로 균이 배양된 Indole 배지(SIM 배지)에 Kovacs 시약(HCl+효소)을 4~6방울 떨어뜨려 흔들어준다. SIM 배지는 Indole 생산 확인도 가능하지만+++생성, 운동성 관찰도 가능하다. 위 실험에서는 Proteus vulgaris 균이 잘못되어 Indole 생산, H2S+++생성, 운동성을 볼 수가 없다. 

*운동성 확인하는 배지는 시험관 굵은 데에 배지 만들 것!


Phenylalanine이 분해되어 Phenyl pyruvic acid가 되는지 실험해보자.
P.암모나이트, P.암모나이트, PAD 배지, FeCl3(Ferric chloride), 백금이, 알코올램프
①사면배지 윗부분을 살짝 가열한다. (잡균과 습기 제거)
②멸균한 백금이로 균 집락을 따 1cm 띄우고 구불구불하게 접종한다.
③사용한 백금이는 알코올램프에 멸균시키고 하루 동안 배양한다.
➃FeCl3(Ferric chloride)를 떨어뜨려 10분 이내에 녹색으로 변하였는지 판독한다.

O2 존재하에 탈 아민 효소(deaminase)생성 여부를 보는 실험.
Phenylalanine+세균(Phenylalanine deaminase)+O2(호기적 환경)
→Phenyl pyruvic acid(PPA)+Ammonium PPA+FeCl3(Ferric chloride) ⇒녹색

FeCl3(Ferric chloride)를 3~4방울 떨어뜨려 1~2분 후 녹색으로 변하면 양성이다. PAD 양성 세균에는 Proteus, Morganella, providencia가 있으며 PPA 반응은 시약을 떨어뜨린 후 시간이 지나면 색이 퇴색되므로 10분 이내에 판독해야 한다. 

또한, 위 실험에서 P.암모나이트 균 상태가 좋지 않아 FeCl3를 떨어뜨렸을 때 녹색을 띠지 않았지만, 녹색이 나타나야 한다.


Glucose 분해, Lactose 분해, Sucrose 분해, 가스 생성, H2S 생성을 보자.
Proteus vulgaris, Proteus 세포와 조직검사 하고, TSI 사면배지, 백금이, 알코올램프
①사면배지 윗부분을 살짝 가열한다. (잡균과 습기 제거)
②멸균한 백금이로 균 집락을 따 1cm 띄우고 구불구불하게 접종한다.
③사용한 백금이는 알코올램프에 멸균시키고 하루 동안 배양한다.

TSI 배지는 생화학 성상을 볼 때 사용하는 배지 중 하나이며 Glucose, Lactose, Sucrose 발 효능, 가스 생성과 H2S+++생성을 볼 수 있는 배지이다. 위의 실험에서 Proteus vulgaris 균이 오래되었거나 순수한 균이 아니므로 결과가 잘못 나왔다. 배지에 균을 접종할 때는 1cm 띄워 구불구불하게 접종하는데 이때 너무 많이 띄우게 되어도 결과가 잘 못 나올 수 있으므로 주의하고 실험해야 한다. Proteus vulgaris 을 잘못 접종하였을 때 k/k로 결과가 보이며 제대로 다시 균을 접종하게 되면 A/AG H2S+++가 나오는 것이 올바르다. TSI 배지에는 Phenol red가 들어가 있어 Glucose, Lactose, Sucrose 발효를 하게 되면 노란색으로 보이고 황화수소 생성 시엔 아랫부분이 흑색으로 나타나게 된다.



                           
                         
                         Proteus는 주모 성 편모를 가지고 있어 운동성이 있으며
                          물결 모양의 파도 치는 것처럼 보이는 유주현 상이 보임.
                                                         (=파상 발육)

위 실험하였을 때 순수한 균으로 접종하지 않아 첫 번째 실험에선 볼 수 없었지만 순수한 Proteus 균으로 접종하였을 때 유 주현상(Swarming motility)을 볼 수 있었다. 위와 같은 유주현 상 발생 조건에는 영양구성(Alanine, glutamic acid, 세포와 조직검사 하고 등)이 배지에 있는 경우, 배지의 점도인 agar의 함량을 낮추는 경우가 있으며, 유 주 현상 억제에는 반대로 agar를 5~7% 첨가, 0.1% sodium 병리학 첨가, 식염이 없는 배지, 0.1% chloral hydrate 첨가, 담즙이 첨가된 경우(세균과 배양, SS agar 등), Phenyl ethyl alcohol agar 배지(그럼 음성억제) 등의 경우가 있었다.
Proteus 군종 중 유주하는 균은 P.영국학자, P.vulgaris 2 군종이 있는데 혈액 우무배지에서 자랄 때 다른 집락까지 덮어 퍼지면서 자라는 특징이 있다. 이러한 현상을 유주현 상이라고 하는데 이 2 군종을 구분할 때는 Indole test를 시행하게 된다.
유 주현상을 보이고 Indole 양성이라면 P.vulgaris 이고,
유 주현상을 보이고 Indole 음성이라면 P.강한 세포로 정의한다.